Die Verwendung von Radialflusssäulen (RFC) für großtechnische Chromatographie-Prozesse

Handtmann RFC Columns, RFC Säulen

Handtmann RFC Columns, RFC Säulen

Die Verwendung von Radialflusssäulen (RFC) für großtechnische Chromatographie-Prozesse

Am Beispiel der Lactoferrin Gewinnung aus Milch

Riesiges Marktwachstum │ Lactoferrin (LF) findet sich in der Milch aller Säugetiere. Auch in Milch und Molke, die aus Kuhmilch gewonnen wird. Es ist ein 80 kDa eisenbindendes Protein und macht etwa 0,3 % des Gesamtproteingehalts der Milch aus, was 60 - 200 mg/l entspricht. Die thermische Stabilität beträgt 55°C.
Es ist ein sehr wirkungsvolles Protein: Es hat antibakterielle, antivirale, antimykotische, antitumorale, entzündungshemmende und antiallergische Wirkungen. Aus Kuhmilch isoliert, ist es daher ein begehrtes Additiv für Lebensmittel wie funktionelle Lebensmittel oder Sportlernahrung. Die Verwendung von Lactoferrin hat in den letzten Jahren explosionsartig zugenommen, insbesondere als Zusatz für Babynahrung.

Säulenchromatographie │ Mit Chromatographie werden in der Chemie alle die physikalisch-chemischen Trennverfahren bezeichnet, bei denen der Trennvorgang auf der Verteilung eines Stoffes zwischen einer mobilen und einer stationären Phase beruht. Verschiedene Stoffe einer Probe werden unterschiedlich stark von der stationären Phase zurückgehalten, während die mobile Phase den Transport übernimmt. Chromatographische Analysemethoden können u.a. folgende sein: Klassische Säulenchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Ionenaustauschchromatographie (IEX) als spezielle Form der HPLC. Die schnelle Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) ist eine Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, die häufig zur Analyse oder Reinigung von Proteingemischen eingesetzt wird. Bei der FPLC ist die mobile Phase eine wässrige Lösung oder ein "Puffer". Die Durchflussrate des Puffers wird durch eine Verdrängerpumpe gesteuert und bei konstantem Durchfluss gehalten. Zur Equilibrierung und Elution werden substanzspezifische Puffer benötigt. Um die Elution an den abzutrennenden Stoff anpassen zu können, kann die Pufferzusammensetzung, durch Dosieren der einzelnen Komponenten aus externen Behältern, variiert werden. Die stationäre Phase ist in der Regel ein kugelförmiges Resin, welches z.B. aus vernetzter Agarose oder Polymethacrylaten, besteht, das in eine zylindrische Edelstahlsäule gepackt ist. FPLC-Resine sind, je nach Anwendung, in einer breiten Palette von Partikelgrößen und Oberflächenmodifikationen erhältlich. Bei der Ionenaustauschchromatographie können Stoffe anhand ihrer Ladung aufgetrennt werden. Sie beruht auf der Ausbildung heteropolarer Bindungen zwischen Matrix und mobiler Phase, wodurch das gewünschte geladene Protein bindet. Die Elution kann mittels Gradienten erfolgen. Sobald die ladungsbedingte Bindung zwischen Eluent und Protein höher als zwischen Matrix und Protein ist, wandert das Protein in die Lösung. Durch Detektion des Durchflusses bei 280 nm, kann jedes passierende Protein als Peak detektiert werden. Im Bereich der Lactoferrin Gewinnung wird das LF mittels Ionenaustauschchromatographie gewonnen.

Der Radialfluss │ Der Radialfluss steht für einen kontinuierlichen Fluss und eine hohe Flussrate durch den gesamten Adsorber (24/7), einen niedrigen Differenzdruck bei hoher Flussrate, die Verarbeitung großer Feed-Volumina und eine gute Skalierbarkeit durch Erhöhung der Trennstrecke der entsprechenden Radialflusssäule.

Weitere Vorteile von RFC sind Folgende:

  • Bidirektionaler Fluss
  • Säule sterilisier- und autoklavierbar
  • Verfügbarkeit verschiedener Maschenweiten der Siebgewebe
  • Kleiner Fußabdruck
  • Geringes Totraumvolumen
  • Minimum ΔP
  • Robuste Konstruktion

Das Standard-Säulenvolumen (SV) in der Industrie beträgt 240 bzw. 260 Liter bei einer Trennstrecke von 13,5 cm. Prinzipiell sind bis zu 2000 Liter Resinvolumen pro Säule möglich. Bei Bieranwendungen ermöglicht dies einen Verarbeitungsdurchsatz von ~ 22.000 Litern pro Stunde, bei Milchanwendungen ~ 15.000 Liter pro Stunde.

Axial- vs. Radialflusssäule │ Während eine Axialflusssäule den Vorteil der höheren Flexibilität in der Trennstrecke bietet, hat die Radialflusssäule jedoch viel mehr zu bieten. Folgend sind die Spezifikationen für eine Radialflusssäule aufgeführt, die eine Radialflusssäule einer Axialflusssäule überlegen machen:

  • Um 20 – 50 % reduzierter Druckabfall
  • Verbesserte Ladeeffektivität
  • Reduzierte Komplexität bei der Zufuhr-Handhabung
  • Hohe Bindungskinetik (dynamische Bindungskapazität)
  • Hohe Prozessrobustheit (größeres Prozesstoleranzfenster)
  • Höherer Durchsatz
  • Höhere Effizienz
  • Höhere Reinheit

Ist es möglich, bestehende Prozesse von Axial- auf Radialfluss umzustellen? │ Eine Umstellung von Axial- auf Radialfluss ist möglich, solange die erforderliche Trennstrecke für die effiziente Trennung maximal 13,5 cm beträgt, was bei den meisten auf Ionenaustausch basierenden Chromatographie-verfahren der Fall ist. Die Umstellung von Axial- auf Radialfluss kann, wie bereits oben beschrieben, wie folgt begründet werden: Radialflusssäulen haben deutlich niedrigere Drücke als Axialsäulen. Dies bedeutet, dass die Säule mit einer höheren Flussrate betrieben werden kann, was zu einem höheren Durchsatz und, im Verhältnis zur Zeit, zu einer höheren Ausbeute führt.

Wie Lactoferrin aus Milch extrahiert wird │ Für die industrielle Extraktion des Proteins Lactoferrin aus Milch und Molke werden auf Radialflusssäulen basierende Chromatographieanlagen eingesetzt. Die Vollmilch wird in Milchviehbetrieben gesammelt und bis zum Bestehen der Qualitätsprüfung ge-kühlt gelagert und zu einer Molkerei transportiert. Sobald die Milch in der Molkerei angekommen ist, wird sie einer Rahmtrennung unterzogen, um Fett zu entfernen und Magermilch zu sammeln. An-schließend durchläuft die Magermilch einen Pasteurisierer, um krankheitserregende Bakterien abzutöten, bevor sie weiterverarbeitet wird. Für die Extraktion von Lactoferrin (bLF) besteht die ideale Option darin, das Lactoferrin vor dem Pasteurisierungsschritt zu extrahieren. In solchen Fällen wird Magermilch durch eine mit SP SepharoseTM Big Beads Resin (z.B. quervernetzte Agarose) gepackte Chromatographiesäule gepumpt, bis die maximale Bindungskapazität des Resins erreicht ist. Die Säule wird dann mit Wasser und Niedrigsalz-Puffern gewaschen, bevor das Lactoferrin durch Anwen-dung einer spezifischen Salzlösung eluiert wird. Danach wird das Resin in der Säule durch ein CIP-Ver-fahren unter Verwendung von Natriumhydroxid (NaOH) für den nächsten Reinigungszyklus regene-riert. Die gereinigte Lactoferrin-/Salzlösung wird weiterverarbeitet um mittels Diafiltration (DF) und Ultrafiltration (UF) das Salz zu entfernen und die Lösung aufzukonzentrieren. Anschließend wird das LF-Konzentrat einem Pasteurisierungsschritt oder einer Mikrofiltration unterzogen, um pathogene Bakterien abzutöten oder zu entfernen. LF wird in einem zweiten UF-Verfahrensschritt weiter auf-konzentriert und dann mit Gefriertrocknungs- oder Sprühtrocknungstechnologien getrocknet. Das Pulver wird formuliert und zu einer gewünschten Packungsgröße verpackt. Dieser Prozess ermöglicht eine hohe Reinheit >95 % sowie eine sehr hohe Bioaktivität durch schonende Behandlung.

Anwendungen der Säulenchromatographie │ Neben der Lactoferrin-Extraktion wird die Radialflusssäule auch in der Lebensmittelindustrie und bei großtechnischen Chromatographie-Prozessen eingesetzt.

Hier nur einige wenige Anwendungsbereiche:

  • Bitterstoffe aus Zitrussäften
  • Isoflavone aus Soja
  • Taurin-Extraktion
  • Entfernung von Omega-3-Fettsäure aus Fischölen
  • Extraktion von Kartoffelprotein
  • Kollagenextraktion aus Fisch- und Tierhaut
  • Entfernung von Riboflavin aus Molke